核酸提取
2022-11-30
核酸提取

核酸提取是指将核酸(DNA和RNA)从细胞中提取出来的过程,总的来说包括细胞裂解、核酸纯化及后续核酸浓度、纯度测定的步骤。根据原始样品的种类和核酸产物后续的各种应用目的,细胞裂解和核酸纯化步骤有不同的处理方法和要求。


一、实验室中的DNA提取:

案例一:小鼠基因型判定实验的模板DNA提取

初始样品为小鼠尾切段。基因型判定实验对DNA模板的浓度、纯度要求不高,消化提取过程相对简单。


实验步骤:

1.将1cm尾巴切段置于1.5mL微量离心管中,加入适量裂解液(Lysis buffer)和蛋白酶(Proteinase K)于55~65℃水浴过夜消化。

2.充分消化后的尾巴样品加入沉淀液(Precipitation buffer)后用旋涡混匀器来使杂质蛋白充分沉淀,杂质沉淀后通过离心操作(如4℃,4000Xg,5min),取出溶有目标DNA的上清液,丢弃杂质沉淀。

3.上清液中加入100%异丙醇,小心颠倒离心管30~40次,便可以将产物DNA沉降。离心操作(4℃,10000Xg或12000rpm,10min)去除上清。

4.用75%乙醇洗涤两次DNA产物,待乙醇充分挥发后,用水或TE缓冲液(Tris-EDTA buffer)收获DNA模板产物。


进行后续的PCR扩增实验前,可以使用Nanodrop仪器来进行DNA浓度和纯度的测定来提高PCR反应的成功率。在PCR扩增实验不顺利的情况下,也可以进一步对DNA产品的完整度进行检测,具体方法可以参考核酸检测和核酸扩增的有关内容。


案例二:用于重组的质粒DNA提取

用于重组的质粒对DNA产物的浓度、纯度和完整度都要求较高,否则无法成功完成质粒酶切和酶连的步骤。


实验步骤:

1.从含有过夜培养大肠杆菌的试管中取出适量菌液置于微量离心管中,低速离心(4000Xg, 5min)处理后收获大肠杆菌,除去培养液。

2.使用质粒提取试剂盒(Plasmid DNA extraction kit)提取大肠杆菌质粒。原理菌体裂解后,加入中和液(Neutralization buffer)过微型柱,使DNA特异结合于柱上,而其他杂质会过柱洗脱。最后用洗脱液(Elute buffer)洗下DNA即可得到质粒DNA产物。

3.经试剂盒提取后的质粒DNA有时需要经电泳切胶回收的操作将目标质粒DNA与其他DNA分离。切下的胶消化后经DNA纯化试剂盒纯化即可得到纯度较高的目标质粒DNA。具体的内容可以参考核酸检测的有关内容。


二、实验室中的RNA提取

[ RNA Extraction: Principle, Procedure, Protocol and Importance  – Genetic Education]:

RNA提取过程与DNA类似,也是通过裂解细胞后通过有机溶剂(苯酚、氯仿、异戊醇)沉降杂质的方法来分离RNA。但RNA的稳定性比DNA低很多,因此对RNA提取对温度和污染清除的要求更高。实研操作一般从以下几个角度来提升成功率:降低RNA水解酶活性、提升RNA稳定性、使RNA与DNA和蛋白分离、仅沉降RNA、有效去除DNA。


案例一:总RNA提取

实验步骤与DNA提取类似,但有机溶剂的使用会有所不同。在首次离心后,混合物会分为三层,RNA溶于上层无色水相,而DNA和蛋白会处于中间层,组织残渣等杂质处于底层酚-氯仿相中2

实验步骤:

1.向提取样品中加入裂解液(如Trizol),裂解细胞与组织,室温静置5-8分钟。

2.加入氯仿,充分混匀后离心(4℃,12000rpm,10min),取出上清液。

3.向上清液中加入异丙醇沉降RNA,并离心(4℃,12000rpm,10min)弃去上清。

4.用75%乙醇洗涤产物两次,待乙醇挥发后加入RNase-free水溶解产物。


实验中用到的耐思耗材和仪器:

枪头、微量离心管、(15、50mL)离心管、迷你旋涡分离器(105003)。

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